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02021年8月23日/醫(yī)麥客新聞 eMedClub News/--最近幾年，腫瘤免疫細(xì)胞療法發(fā)展迅速，尤其是CAR-T細(xì)胞，已經(jīng)有五款CAR-T細(xì)胞療法產(chǎn)品獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。國(guó)內(nèi)也迎來(lái)了第一款CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的上市。
NK細(xì)胞的安全性及其抗腫瘤潛力，使它們成為實(shí)施CAR技術(shù)的有希望的細(xì)胞類型，可將其細(xì)胞毒性潛力重定向至特定靶標(biāo)。目前，CAR-NK細(xì)胞的免疫療法研究成為越來(lái)越多研究者的選擇方向。
▲ NK細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性機(jī)制
NK細(xì)胞來(lái)源非常廣泛，比如外周血、臍帶血、胚胎干細(xì)胞、人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和NK細(xì)胞系，不同來(lái)源的NK細(xì)胞有著各自的優(yōu)勢(shì)和缺陷。由于NK細(xì)胞可以經(jīng)歷的細(xì)胞分裂數(shù)量有限，很難擴(kuò)增為輸注所需的大量細(xì)胞。因此，研究者們逐步使用NK細(xì)胞系（如NK-92、YTS、KHYG-1等）代替從臍帶或外周血獲得的原代NK細(xì)胞進(jìn)行了研究。
CAR-NK細(xì)胞的研究進(jìn)展
在血液系統(tǒng)腫瘤中，目前研究較多的為CD19-CAR-NK細(xì)胞和CD33-CAR-NK細(xì)胞。
▲ CAR-NK細(xì)胞在血液瘤中的臨床前研究
1.急性白血病
CAR-T細(xì)胞治療急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）已顯示出顯著臨床療效，但該療法對(duì)急性髓系白血?。ˋML）療效不佳。從理論上講，CAR-NK細(xì)胞比CAR-T細(xì)胞具有更有利的毒性，特別是在避免CRS等副作用方面。然而，這方面的臨床數(shù)據(jù)尚無(wú)報(bào)道。
Xiaowen Tang等評(píng)估了CD33-CAR-NK細(xì)胞在復(fù)發(fā)和難治性AML患者中的安全性。該研究共入組3例患者，采用第二代CAR，結(jié)果顯示在5x109個(gè)細(xì)胞的輸注劑量下，沒(méi)有明顯的不良反應(yīng)，并且與CAR-T細(xì)胞相比，CAR-NK-92細(xì)胞的成本生產(chǎn)更低，相信經(jīng)過(guò)優(yōu)化后將被廣泛用于治療腫瘤。
2.淋巴瘤
MD安德森腫瘤中心I/IIa期試驗(yàn)的結(jié)果顯示，以CD19為靶點(diǎn)的臍帶血來(lái)源的CAR-NK細(xì)胞療法，在復(fù)發(fā)性/難治性非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者和慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）患者中顯現(xiàn)出臨床療效，而且未觀察到嚴(yán)重毒性反應(yīng)。
該研究共入組11例患者，其中5例CLL患者，6例NHL患者，所有患者均接受最少3線和最多11線的先前治療。8例患者（73%）獲得緩解，其中7例（4例淋巴瘤，3例CLL）完全緩解，1例Richter’s轉(zhuǎn)化成分緩解，但有持續(xù)性CLL。
在注射后30天內(nèi)，所有劑量水平的反應(yīng)都很迅速，注入的CAR-NK細(xì)胞擴(kuò)增并維持在低水平至少12個(gè)月。另外，研究結(jié)果表明，CAR-NK細(xì)胞的使用與CRS、神經(jīng)毒性或GVHD的發(fā)生無(wú)關(guān)，炎癥細(xì)胞因子（包括IL-6）的水平也沒(méi)有增加。
Fate Therapeutics公司近期公布異體iPSC衍生的CAR-NK細(xì)胞FT596的臨床數(shù)據(jù)，F(xiàn)T596單藥治療表現(xiàn)出持久的腫瘤清除能力和延長(zhǎng)的體內(nèi)存活率，顯示出iPSC衍生的NK細(xì)胞療法成為新型癌癥免疫療法的開(kāi)發(fā)前景。
此外，F(xiàn)T596在與利妥昔單抗聯(lián)用時(shí)，與單獨(dú)使用利妥昔單抗相比，F(xiàn)T596在體內(nèi)顯示出對(duì)CD20+淋巴瘤細(xì)胞殺傷的增強(qiáng)。這初步顯示出，抗體藥物與NK細(xì)胞治療聯(lián)合應(yīng)用可以發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，將會(huì)是CAR-NK細(xì)胞又一個(gè)開(kāi)發(fā)新方向。
3.多發(fā)性骨髓瘤（MM）
MM是在B淋巴細(xì)胞分化成漿細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)生的遺傳突變導(dǎo)致的惡性腫瘤。MM細(xì)胞系中常見(jiàn)的腫瘤抗原有CS1、CD138、BCMA等。關(guān)于CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)品治療MM的研究相對(duì)較少。目前用于治療MM的CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)品多采用NK92細(xì)胞系，所采用的腫瘤抗原多為CS1和CD138。
細(xì)胞表面糖蛋白CD2子集1（CS1）是MM細(xì)胞表面高度表達(dá)的蛋白質(zhì)，多參與MM細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)。CD138參與MM細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)和成熟，是MM主要的診斷標(biāo)記。體外研究已經(jīng)證實(shí)，分別利用CS1和CD138為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的CS1-CAR-NK92細(xì)胞和CD138-IFNα-CAR-NK92細(xì)胞成功抑制MM細(xì)胞生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了骨髓瘤小鼠的存活期。
CAR-NK用于治療實(shí)體瘤的研究
CAR-T細(xì)胞在抗擊實(shí)體腫瘤的過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)PD-1/PD-L1介導(dǎo)的免疫抑制。NK細(xì)胞表面PD-1表達(dá)很低，相對(duì)受腫瘤微環(huán)境免疫抑制小，也許是抗擊實(shí)體瘤的良好候選者。
在實(shí)體瘤研究中，CAR-NK細(xì)胞的研究靶點(diǎn)多是靶向表達(dá)HER2、PSMA、mesothelin、ROBO1或MUC1等腫瘤相關(guān)抗原的轉(zhuǎn)移性實(shí)體惡性腫瘤，例如前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌和非小細(xì)胞肺癌。
▲ CAR-NK細(xì)胞在實(shí)體中的瘤臨床前研究
目前，CAR-NK針對(duì)實(shí)體瘤的治療逐漸展開(kāi)。
CAR-NK細(xì)胞的挑戰(zhàn)
盡管CAR-NK細(xì)胞吸引了很多研究者的目光，其也存在一定問(wèn)題。CAR-NK細(xì)胞作為一種治療性癌癥的成功實(shí)施目前受到三個(gè)主要因素的阻礙，即，（1）NK細(xì)胞對(duì)基因工程的抗性；（2）NK細(xì)胞的增殖潛力有限；（3）它們對(duì)輸液的持久性有限。
NK細(xì)胞對(duì)基因工程的抗性挑戰(zhàn)
病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR-NK細(xì)胞的挑戰(zhàn)
盡管CAR-NK細(xì)胞吸引了很多研究者的目光，其也存在一定問(wèn)題。CAR-NK細(xì)胞作為一種治療性癌癥的成功實(shí)施目前受到三個(gè)主要因素的阻礙，即，（1）NK細(xì)胞對(duì)基因工程的抗性；（2）NK細(xì)胞的增殖潛力有限；（3）它們對(duì)輸液的持久性有限。
NK細(xì)胞對(duì)基因工程的抗性挑戰(zhàn)
從歷史上看，逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒對(duì)原代NK細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率均較差。基于γ逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體需要細(xì)胞積極增殖才能進(jìn)入細(xì)胞。慢病毒的載體既可以感染循環(huán)細(xì)胞也可以感染非循環(huán)細(xì)胞，并攜帶較大的轉(zhuǎn)基因，但由于其生存能力往往受到負(fù)面影響，因此它們?cè)谠鶱K細(xì)胞中的效率也受到限制。
電穿孔
基因工程NK細(xì)胞的一種非病毒策略是通過(guò)DNA或mRNA質(zhì)粒的電穿孔。DNA的電穿孔效率很低，且無(wú)法在DNA中穩(wěn)定整合構(gòu)建體。
轉(zhuǎn)座子
目前正在研究的非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種替代方法是使用轉(zhuǎn)座子。最常用的兩種主要方法——piggyBac和睡美人(SB)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，目前正在臨床測(cè)試基于SB的CAR載體。
SB最初來(lái)源于魚(yú)類，但在人類基因組中仍保留其活性。它由兩個(gè)部分組成：介導(dǎo)剪切和粘貼的SB轉(zhuǎn)座酶和側(cè)翼為末端反向重復(fù)序列(TIR)的DNA載體，轉(zhuǎn)座酶可以與之結(jié)合以介導(dǎo)其幾乎隨機(jī)整合到基因組中。
這種方法可以轉(zhuǎn)導(dǎo)長(zhǎng)度大于100kb的基因，使其成為CAR整合的一個(gè)有吸引力的更高效率選擇。轉(zhuǎn)座子工程化的CAR-NK細(xì)胞是一種有前途的替代方法，可以在沒(méi)有病毒整合的情況下實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)。
CRISPR/Cas9
先前討論的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法依賴于載體整合，而沒(méi)有指定整合位點(diǎn)。必需存活基因或腫瘤抑制基因的整合和隨后破壞的可能性對(duì)于臨床產(chǎn)品可能是有害和危險(xiǎn)的。與轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)或鋅指核酸酶(ZFN)等類似方法相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)開(kāi)啟了高效靶向基因整合的可能性。
解決NK細(xì)胞的增殖潛力有限的挑戰(zhàn)
1.基于細(xì)胞因子的擴(kuò)增
基于細(xì)胞因子的擴(kuò)增方案通常依賴于超生理水平來(lái)誘導(dǎo)原代NK細(xì)胞的擴(kuò)增。
2.基于飼養(yǎng)層的擴(kuò)增
基于飼養(yǎng)層的擴(kuò)增方案將來(lái)自飼養(yǎng)層系統(tǒng)的受體介導(dǎo)的輸入與細(xì)胞因子支持相結(jié)合，以促進(jìn)原代NK細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增。
解決NK體內(nèi)擴(kuò)增的挑戰(zhàn)
來(lái)自過(guò)繼細(xì)胞療法(ACT)臨床試驗(yàn)的證據(jù)通常無(wú)法在輸注后1-2周內(nèi)檢測(cè)到輸注NK細(xì)胞的存在。雖然NK細(xì)胞的短壽命有助于它們?cè)贏CT環(huán)境中的安全性，但它也顯著縮小了治療窗口。
小結(jié)
目前，全球正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)進(jìn)行的薈萃分析確定了520項(xiàng)有效試驗(yàn)，共檢查了64種不同的CAR，其中96.4％的試驗(yàn)使用CAR-T細(xì)胞。因此，就將實(shí)驗(yàn)室研究轉(zhuǎn)化為臨床環(huán)境而言，CAR-NK細(xì)胞領(lǐng)域仍處于起步階段。
▲ CAR-NK細(xì)胞在血液瘤和實(shí)體瘤中的臨床研究
隨著CAR-NK細(xì)胞療法的臨床價(jià)值凸顯，不管是賽諾菲、百時(shí)美施貴寶等制藥巨頭還是Catamaran Bio、Artiva Bio等生物技術(shù)初創(chuàng)公司都相繼布局CAR-NK賽道。顯而易見(jiàn)，CAR-NK已成為繼CAR-T之后最引人關(guān)注的工程細(xì)胞療法。
近些年隨著對(duì)NK的細(xì)胞生物學(xué)，免疫學(xué)，以及記憶性NK細(xì)胞的研究和認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入以及對(duì)于NK細(xì)胞的免疫相關(guān)受體的信號(hào)通路等新的研究.。越來(lái)越多的研究為NK細(xì)胞在免疫治療中的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)，相信隨著理論知識(shí)的更加完善，臨床研究的進(jìn)行，以及對(duì)當(dāng)前CAR-NK細(xì)胞面臨挑戰(zhàn)的攻克，CAR-NK細(xì)胞療法也許會(huì)為腫瘤免疫治療帶來(lái)革命性進(jìn)展，CAR-NK細(xì)胞的治療方法在今后也能占據(jù)一方舞臺(tái)。
參考資料：
1.https://mp.weixin.qq.com/s/a8PZZLfWYf684aH4BfkVUQ
2.https://mp.weixin.qq.com/s/nLKPgREeE3jLJ4O9XxQQEw
近些年隨著對(duì)NK的細(xì)胞生物學(xué)，免疫學(xué)，以及記憶性NK細(xì)胞的研究和認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入以及對(duì)于NK細(xì)胞的免疫相關(guān)受體的信號(hào)通路等新的研究.。越來(lái)越多的研究為NK細(xì)胞在免疫治療中的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)，相信隨著理論知識(shí)的更加完善，臨床研究的進(jìn)行，以及對(duì)當(dāng)前CAR-NK細(xì)胞面臨挑戰(zhàn)的攻克，CAR-NK細(xì)胞療法也許會(huì)為腫瘤免疫治療帶來(lái)革命性進(jìn)展，CAR-NK細(xì)胞的治療方法在今后也能占據(jù)一方舞臺(tái)。
參考資料：
1.https://mp.weixin.qq.com/s/a8PZZLfWYf684aH4BfkVUQ
2.https://mp.weixin.qq.com/s/nLKPgREeE3jLJ4O9XxQQEw
